软骨细胞复合物修复兔耳廓软骨缺损

作者：刘彦春　王炜　曹谊林　商庆新　夏万尧　钟伟

　　关键词： 聚羟基乙酸；软骨细胞；体外培养；组织缺损修复

　　【摘要】　目的　在有免疫力的动物兔体内探索组织工程化软骨对软骨缺损的修复能力。方法软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后修复兔耳廓软骨缺损，与对照组比较，并从大体及组织学进行评价。结果　软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后回植到兔耳廓软骨缺损部位，软骨缺损得到修复，但与正常软骨交界处为纤维组织。注射软骨细胞悬液、以聚羟基乙酸支架修复及空白对照组软骨缺损均未修复。结论　软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后在有免疫力的动物兔体内可修复耳廓软骨缺损，但存在着界面愈合问题。

Repair of rabbit auricular defects using chondrocyte-scaffolding constructs

LIU Yanchun, WANG Wei, CAO Yilin, et al.Deparment of Plastic Surgery, Ninth People's Hospital of Shanghai， Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011

　　【Abstract】Objective To evaluate if the tissue-engineered cartilage can repair the auricular defects in rabbits that have inherent immunity.Methods Rabbit auricular defects were repaired using chondrocyte-PGA constructs cultured in vitro. The gross and histological comparisons were made between the experimental and the control groups.Results The rabbit auricular defects were repaired with chondrocyte-PGA constructs, leaving fibroid tissue in the interface between the tissue-engineered cartilage and the normal cartilage.Conclusion The auricular defects can be repaired by chondrocyte-PGA in vitro cultured constructs in animals like rabbits that have acquired immunity. The interface healing problems need further study.

　　【Key words】 Polyglycolic acid Chondrocytes In vitro culture Repair of tissue defect

　　目前有关组织工程化软骨的形成及其应用研究大部分是在无免疫力的裸鼠体内进行［1］，组织工程技术要过渡到临床应用，必须完成由低等动物向高等动物的过渡。我们在有免疫力的动物兔体内形成组织工程化软骨的基础上进一步探讨利用组织工程技术修复兔耳廓软骨缺损，为临床应用奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　聚羟基乙酸支架的表面修饰　将直径15μm、纤维间隔150～200μm、厚度100μm的聚羟基乙酸(Polyglycolic acid,PGA)无纺网(DAVIS-GECK公司提供)以2%的聚乳酸二氯甲烷溶液包埋固定再分别以1%的卵磷脂无水乙醇溶液及10%多聚赖氨酸包埋，以75%酒精浸泡及紫外线照射消毒后保存于干燥器内备用。

　　1.2　软骨细胞悬液制备［2］　新西兰大白兔24只(体重2.0～2.5kg,雌雄不限)随机分成：实验组8只，对照Ⅰ组8只，对照Ⅱ组4只，对照Ⅲ组4只。全麻下将实验组和对照Ⅰ组计16只兔一侧耳廓从根部切下，剥去皮肤及软骨膜，剪成0.1cm×0.1 cm大小的碎片，以磷酸盐缓冲液(PBS，含青霉素200U/ml，链霉素200μg/ml)冲洗两遍，以去除残余血迹。然后加入两倍于软骨体积的Ⅱ型胶原酶(3mg/ml)在37℃恒温振荡器内消化。4～5h收获细胞一次，2～3次后软骨碎片完全溶解，细胞从基质中释放出来。经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液，浓度为5×107个/ml。

　　1.3　培养液用F-12培养基加入10%的小牛血清及青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

　　1.4　细胞支架复合物体外培养　将制得的PGA支架裁剪成1.5cm×2.0cm大小，计16个，其中8个分别加入实验组8只兔各自软骨细胞悬液250μl，然后将细胞支架复合物分别置于60mm培养皿中，放入37℃5%CO2培养箱中，4h后加入F-12培养液5ml，抗坏血酸50μg/ml，人转化生长因子-β110ng/ml,人碱性成纤维细胞生长因子2ng/ml。培养液每3天更换一次。定期在倒置显微镜下观察细胞与支架的吸附、生长繁殖及基质产生情况。

　　1.5　软骨缺损的修复　于实验组、对照I组另一侧耳廓及对照Ⅱ、Ⅲ组双侧耳廓软骨根部形成1.5cm×2.0cm大小的软骨缺损。修复方法见表1，实验组以体外培养1周的自身软骨细胞-PGA支架复合物修复；对照Ⅰ组以自身单纯软骨细胞悬液注射修复；对照Ⅱ组单纯PGA支架修复；对照Ⅲ组为空白对照。3个月后对所有缺损进行大体观察及组织学检测。

　　2　实验结果

2.1　细胞支架复合物体外培养期间观察　培养期间倒置显微镜观察及扫描电镜检测见软骨细胞吸附在支架纤维表面，在支架纤维之间有较多呈蜘蛛网样分布的基质产生(图1)。

图1　软骨细胞-PGA支架复合物体外培养，细胞吸附在支架纤维表面，有呈蜘蛛网样分布的基质产生

　　Fig 1　 The culture of chondrocytes-PGA constructs in vitro, demonstrating the chondrocytes absorbed on the surface of PGA fibers and produced enormous cobweboid matrices (Indicated by black arrow, scanning electron microscope ×600)

　2.2　软骨缺损修复观察　3个月后对24只兔32个耳廓软骨缺损的修复情况大体观察见图2，3。组织学检测证实实验组软骨缺损被再生的组织工程化软骨组织修复，其中PGA支架已完全降解吸收，再生的组织工程化软骨与周围软骨之间可见纤维组织连接(图4)。对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组软骨缺损为纤维组织修复。

　　3　讨论

　　3.1　软骨损伤或疾病后自发修复能力有限，目前常用的异体软骨移植存在着供体匹配、组织保存、供体不足、感染机会增加及传播疾病等问题；自体软骨移植可造成供区损伤，同时也存在着来源受限的问题；使用人工合成生物材料存在着许多潜在的危险和并发症，如感染、外露、断裂、植入体的松脱及与宿主免疫系统的反应都限制了它们的使用。 

　　图2　以体外培养的软骨细胞-PGA支架复合物修复的兔耳廓软骨缺损大体观，缺损被软骨组织修复(↑)，组织工程化软骨与正常软骨之间可见纤维组织连接.

　　Fig 2 The gross experimental specimen,noting the repair of the rabbit auricular defect by means of chondrocyte-PGA constructs cultured in vitro and the defect repaired by newly generated cartilage (Indicated by black arrow) 

　　图3　三个对照组兔耳廓软骨缺损修复大体观，缺损表面覆有纤维组织，软骨缺损仍存在(↑)

　　Fig 3 The gross control specimen, noting the repair of rabbit auricular defects in three control groups and the existence of cartilage defects covered with fibrous connective tissues

图4　以体外培养的软骨细胞-PGA支架复合物修复的兔耳廓软骨缺损组织学照片，组织工程化软骨与正常软骨之间嵌有纤维组织(↑，HE染色 ×10)

Fig 4　Histological photography of rabbit auricular defects repaired by chondrocyte-PGA constructs cultured in vitro, demonstrating the existence of fibrous connective tissues between the tissue-engineered cartilage and the original cartilage (Indicated by black arrow, HE ×10)

　　3.2　近年兴起的组织工程技术为软骨缺损的修复开辟了一条新的途径。目前已在裸鼠体内形成了软骨、骨和肌腱组织；按人耳廓形态形成复杂的软骨结构也有报道［3］，并已利用组织工程化软骨进行替代鼻中隔软骨、关节软骨及气管软骨的应用研究。但上述实验大部分是在无免疫力的裸鼠体内进行。组织工程技术要过渡到临床应用，必须完成由低等动物向高等动物的过渡。

　　3.3　我们通过将兔耳廓软骨细胞种于经修饰的PGA支架上回植到兔体内后形成了软骨组织，进一步探讨了组织工程化软骨在有免疫力的动物体内对软骨缺损的修复能力。实验证明将软骨细胞种于经修饰的PGA支架上体外培养后对软骨缺损具有修复能力，其中组织工程化软骨形成的关键在于软骨细胞与PGA体外培养期间有大量的基质产生。但再生软骨与正常软骨之间存在着界面愈合问题，可能由于组织工程化软骨在体内形成需要一定时间，在这段时间里纤维组织嵌插于组织工程化软骨与正常软骨之间，影响了组织工程化软骨与正常软骨之间的愈合，尚有待进一步研究；单纯注射软骨细胞悬液，因软骨细胞无附着的锚基，细胞注射到体内后迅速流失，且不易存活，所以无软骨组织形成［4］。另外因无形成软骨的细胞来源及软骨再生能力有限，所以单纯PGA修复组及空白对照组软骨缺损均未修复。

　　参考文献

　　1　Vacanti CA, Upton J.Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices. Clin Plast Surg, 1994, 21:445-462.

　　2 Klagsbrum M. Large-scale preparation of chondrocytes. Methods Enzymol, 1979, 58:560-564.

　　3　Cao YL, Vacanti JP, Paige KT, et al. Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear. Plast Reconstr Surg, 1997; 100:297-302.

　　4 Atala A, Mooney DJ, Vacanti JP, et al. Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Boston:Hamilton Printing Co, 1997:51-83.