质酸刺激因子对兔耳创面愈合的影响

　　作者：彭湃　鲁开化　艾玉峰　郭树忠

　　摘　要　目的：证实透明质酸刺激因子（hasf）对缺血创面愈合的促进作用，为临床应用提供理论及实验依据．方法：应用本科实验室提纯的hasf，稀释成25,50,100及200 mg/l4种不同浓度，并以生理盐水（ns）及透明质酸（ha）作对照，作用于兔耳缺血创面，进行大体观察及显微测量．结果：用药组创面愈合速度快于对照组，两者相比有显著差异（p＜0.01）．结论：hasf能够提高兔耳缺血创面愈合速度，改善愈合质量．

　　 关键词：透明质酸刺激因子　创面　伤口愈合

　　引言

　　透明质酸刺激因子(hyaluronic acid stimulating factor,hasf)的提取多来自于胎儿血清、受孕母体羊水及肿瘤患者血清，属一种高分子糖蛋白，它主要是通过刺激成纤维细胞产生丰富的透明质酸(ha)，再通过ha或hasf与细胞受体的结合来促进组织的修复．我们的目的就是将其应用于兔耳缺血创面模型，证实hasf对缺血创面愈合的促进作用，为以后的临床应用提供理论及实验依据．

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　活检打孔器（d=6 mm 美国）；bh-2型olympus光学显微镜（日本olympus公司）；显微测微标尺（国产）;ha（sigma公司);hasf（本科实验室）．

　　1.2　方法

　　1.2.1　ha及hasf的配制　ha配制浓度为0.5 g/l，hasf为本科实验室从孕兔羊水、胎兔血清中提纯．配制浓度为25,50,100及200 mg/l（f25,f50,f100,f200）．

　　1.2.2　缺血模型的制备及实验分组　新西兰白兔16只，体质量1.9 kg～2.8 kg，雌雄不限．在距兔耳根部1 cm处将耳背及耳腹侧皮肤环切，结扎中央动脉及头侧动脉之总干，保留尾侧动脉．在耳背对称制作d=6 mm的4个圆形创面，剥去软骨膜，暴露软骨．实验组：f25,f50,f100,f200组．对照组：ha,生理盐水组．一侧兔耳创面分别滴加f25,f50,f100,f200各0.1 ml，另一侧兔耳选取两个创面分别滴加ha及生理盐水各0.1 ml．兔耳及创面的选取均为随机，每日换药加液1次，直创面愈合．

　　1.2.3　大体观察　观察创面愈合过程中皮温、颜色、肉芽生长、上皮爬行等特点的变化，以及愈合时间，并在术后第1,5,9,13,17,21日行创面摄影．

　　1.2.4　标本切取及处理　创面形成后第9日，取半数动物过量戊巴比妥钠静推处死．以每一创面为中心，切取1 cm×1 cm正方形组织块（含兔耳全层），并自创面正中二等分切开．标本固定，制作石蜡切片行he染色，光镜下观测上皮细胞间距（eg）：用显微测微尺（到0.1 mm）测量断面两侧上皮细胞间距．由此推算在术后第9日创面愈合面积：a愈合=（d0/2）2.π-（d/2）2.π．其中d：上皮细胞间距eg；d0：总创面直径6 mm；(d0/2)2.π:总创面面积a总．以及愈合面积占总创面的百分比a愈合/a总×100%．a愈合和a愈合/a总均能准确反映创面愈合速度．

　　2　结果

　　2.1　大体观察　创面形成后，创周青紫水肿，前4 d最明显，9 d以后基本恢复，术后3 d～4 d创缘有少量肉芽形成，5 d后显示实验组及ha组肉芽色泽较红润．术后4 d～5 d创缘有新生上皮爬行．前5 d各组未见明显差别，9 d后实验组及ha组愈合速度快于ns组．愈合后ns组瘢痕较厚且硬，其它组瘢痕较平整．各组在愈合时间上反映差异性(tab 1)．

　　2.2　上皮细胞间距及愈合面积　对愈合面积行方差分析，任意两组间均行两两比较，结果显示，f50,f100,f200,ha 4组之间无差异，其它两两比较均有显著差异(p＜0.01)．这表明，f50,f100,f200,ha 4组愈合速度大于其它两组，而ns组愈合速度明显小于实验组及阳性对照组（ha）．缺血创面，愈合速度与hasf浓度之间存在一定效应关系，即在一定浓度范围内（＜50mg/l）存在剂量依赖性(fig 1)．

图1　hasf浓度与愈合面积

　　fig1　hasf concentrations and healing areas

　　3　讨论

　　近年来研究表明，透明质酸（ha）在组织修复过程中起重要作用．1976年，tomida证实在牛血清中存在一种因子，能刺激培养鼠成纤维细胞产生ha，故命名hasf．目前尚无hasf的氨基酸序列报道，也无该蛋白的标准品．进一步研究表明，其两个主要来源为胎儿肾脏及绒毛膜绒毛［1］．并认为hasf对细胞的作用主要是通过刺激产生ha来实现．成人（成年动物）由于内源性hasf的缺乏，使得伤口ha含量低，持续时间短，影响了愈合速度及质量．通过在缺血创面加入外源性hasf后，可以刺激成纤维细胞产生丰富的ha，为组织的快速增殖修复提供了一个良好的环境［2,3］．其机制可能为:①ha具有较强的“润滑”作用［4］，可以促进细胞的迁移游走；②促进新生毛细血管化［5］；③促进上皮细胞增殖［6］；④调节胶原合成，提高ⅲ型胶原合成比例［7］．

　　创面面积测量有多种方法，如玻片描绘测量法、描绘称重法、自动图像分析法等．有的方法依赖肉眼观察，度差．而计算机图像分析法会因照片的清晰度直接影响灰度对比的测量．我们采用显微镜下测微尺测量法，排除了许多人为因素的干扰，度高，较适用于规则创面的测量．

　　实验结果还表明，外源性hasf对缺血创面修复的促进作用存在着剂量依赖性．当浓度为25mg/l时，有一定的促进作用；浓度为50 mg/l时，作用最明显；当大于50 mg/l时，数值虽然存在差异，但无统计学意义．这可能是因为hasf刺激产生的ha与细胞表面ha受体的结合在一定浓度时达到饱和状态，继续增加浓度也不会产生进一步的有效反应．此外，本科研究生王强［8］初步实验表明，细胞表面可能同时存在着hasf受体，即hasf可以通过更直接的途径达到促进愈合的效果．

　　作者简介：彭　湃，男，1967-12-19生，安徽蚌埠市人，汉族．1991年第四军医大学医疗系毕业，1998年获硕士学位，主治医师，电话：（029）3375305

　　作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心， 陕西　西安 710033

　　参考文献

　　1 sadigh d，longaker mt，hendin b et al．fetal kidney is the source for hyaluronic acid stimulating factor associated with wilm's tumor．j cell biol， 1988;107(10):5930-5935

　　2 kujawa mj,tepperman k．culturing chick muscle cells on glycosaminoglycan substretes: attachment and differantiation．dev biol，1983;99(3):277-286

　　3 kujawa mj,pechak dg,fiszman my et al．hyaluronic acid bonded to cell culture surfaces inhibits the program of hmyogenesis．dev biol，1986;113(1):10-16

　　4 docherty r，forrester jv，lackie jm et al．glyco-saminoglycans facilitate the movement of fibroblasts through threedimemsional collagen matrices．j cell sci，1989;92(3):263-269

　　5 burd dar，greco rm，reganer s et al．hyaluronan and wound healing: a new perspective．br j plast surg，1991;44(5):579-584

　　6 estes jm，adzick ns，harrison mr．hyaluronate metabolism undergoes an ontegenic transition during fetal development: implications for scar-free wound healing．j pediatr surg，1993;28(10):1227-1231

　　7 chindrakasan g，rutka j，stern r．hyaluronic acid stimulates collagen synthesis and levels of type ⅲ collagen in cultures of human fibroblasts．j cell biol，1986;103(3):252-258

　　8 王　强，鲁开化，杨　力et al．透明质酸刺激因子对皮肤成纤维细胞生长动力学的影响．解放军医学杂志，1998；23（6）：454-455