A 型瘦脸对兔耳增生性瘢痕组织

　　A 型瘦脸对兔耳增生性瘢痕组织中P 物质、阻转移生长因子、α平滑肌肌动蛋白的影响

　　王琳 邰宁正 范志宏

　　【 摘要 】 目的 探讨 A 型瘦脸（botulinium toxin tyPe A , BTA ）对兔耳增生性瘢痕组织中 P 物质（ substanceP , SP ）、β1转移生长因子（ transforming growth factor beta-l , TGF -β1）和α平滑肌肌动蛋白 ( alpha Smooth musle actinA ，αSMA ）的影响及意义。方法 12 只日本大耳白兔，体重 3 kg ，建立兔耳增生性瘢痕模型。将兔耳创面分为 BTA 注射组（ I 组）和瘢痕组（ S 组），每组 72 个创面。大体观察创面愈合时间和瘢痕增生情况，统计术后 14d 时的创面愈合率。术后 28d 时，同法另取 6 只兔子的兔耳腹面正常皮肤为空白对照组（ C 组），收集 3 组标本。实时定量 PCR 检测各组标本中 SP 、TGF-β1和α-SMA 的 mRNA 含量， Westem 印迹法检测 α-SMA 的蛋白表达。结果（ l ）术后 14d , I 组与 S 组的创面愈合率的差异无统计学意义； ( 2 ) l 组 SP 和 TGF-β1、。Α-SMA 的 mRNA 含量较 S 组显著降低，但仍高于 C 组（P＜0.05 ) ; ( s ）蛋白水平上， 3 组的α-SMA 表达两组间比较差异均有统计学意义（P＜ 0 . 05 ) ，且 S 组＞ I 组＞ C 组。结论 BTA 注射不延迟创面愈合，并减少了兔耳增生瘢痕中 SP 、TGF -β1和。Α-SMA 的 mRNA 表达，为其治疗增生性瘢痕的临床应用提供了一定的理论依据。

　　【 关键词 】 A 型瘦脸；增生性瘢痕； P 物质；阻转移生长因子； a 平滑肌肌动蛋白

　　Effect of botulinum toxin type A injection on the expression of substanceP , TGF - βl and α- SMA in rabbit ear model of hypertrophic scar  WANG Lin ，TAI NIng- zheng , FAN Zhi-hong . Plastic and Cosmetic Department , Renji Hospital , Shanghai Jiaotong University school of botulinum Mcdicine , Shanghai 200127 , China      

　　[ Abstractl   objective  To investigate the effect of botulinum toxin type A injection  on the expression of substance P , TGF –β1 and α-SMA in rabbit ear model of hypertrophic scar . Methods The hyper trophic scar model was established in 24 Japanese rabbits’ears . The wounds in ventral surface of ear were divided in Groupl ( lateral wounds ) and Group S ( medial wounds ) , 3 wounds each side per ear , totally 72 wounds each group . The wound 一 healing time and the growth of scar were observed and recorded . On postwounding day 28 , the wounds were created in another 6 rabbits in the same way and the normal skin were harvested as Group C . Likewise , the scar samples in Groups 1 and 5 were harvested . The mRNA expression of substanceP , TGF-β1 and α-SMA were detected quantitatively by using realtime PCR and αSMA was also detected with Western blot. Results No difference between the ratio of healed or Infectious Wounds On post Wounding day 14 . The mRNA expression of SP , TGP-β11 and α-SMA in Group l were be was significantly lower than Group S , but higher than those in GroupC ( P < 0 . 01 and < 0 . 05 , respectively ) . The blot density of α-SMA and the ratio of blot density of α-SMA toβ-actin in Group 1 were between that of the other two groups . Conclusion Without delaying the wound-healing , botulinum toxin type A injection significantly decreases the expression of SP , TGF-β1 andα-SMA in rabbit ear model of hypertrophic scar

　　[ Key words ] Botulinurn toxin type A ; Hypertrophi Scar ; Substance P ; Transforming growth factor beta-1 ; Alpha smooth musle actin A

　　P 物质（ SubstanceP , SP ）的异常增高与增生性瘢痕（ hypertrophic Scar , HS ）的疼痛瘙痒和增生挛缩关系密切(Henderson J , Terenghi G , McGrouther DA , et al . The rein nervation pattern of wounds and scars may explain their senso - ry symptoms . J Plast Reconstr Aesthet Surg , 2006 , 59 ( 9 ) : 942-950 .)。研究发现， A 型瘦脸（ botuli num toxin typeA , BTA ）能抑制神劷末梢释放 SP [(Iucioni A , Bale S GT , Lotan TL . Botulinum toxin type A inhibits sensory neuropeptide release In rat bladder models ofa cute injury and chroniC inflammation . BUJ Int , 2008 , 101 ( 3 ) : 366-370 . Wen WD , YuanF , Wang Jl . Botulinurn toxin therapy in the ovalbuminsensitized rat . Neuroimmunomodulation , 2007 , 14 ( 2 ) : 78-83 . )。我们在临床实践中发现， BTA 注射能显著缓解瘢痕的痛痒症状，注射后 6 个月瘢痕外观明显改善。于波等(于波，陈敏亮，刘文阁等． A 型瘦脸预防与治疗早期增生性瘢痕的临床研究．中华医学美学美容杂志， 2008 , 14 ( 2 ) : 95-101)也有相关报道。为进一步探讨 BTA 注射治疗 HS 的作用机制，我们建立了兔耳增生性瘢痕模型，研究 BTA 注射后兔耳增生性瘢痕组织中 sP 书 1 转移生长因子（ transforming growth factor beta-1, TGF-β1）和。平滑肌肌动蛋白（ alpha s mooth musle actinA , aSMA ）的表达变化。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1 ．实验动物： 12 只日本大耳白兔，体重 3 kg ，雌性，由上海交通大学医学院动物中心提供。

　　2 ．试剂与仪器： RNA 提取试剂盒和 Taq 酶（英国玩 vitrogen 公司） , RT 逆转录试剂盒（美国 Ap - plied Biosystems 公司）购自大连宝生物公司。 ABI PRISM 7900Real Time PCR 测序仪（美国 Applied Biosystems 公司）。硝酸纤维素膜（ Millipore ，上海基星生物科技有限公司），鼠抗兔单克隆抗平滑肌肌动蛋白抗体（美国 Sigma 公司），羊抗鼠IgG-HRP （美国 NEB 公司）。

　　一、方法

　　1 ．实验分组和动物模型的建立： 12 只日本大耳白兔分笼饲养 1 周后进行实验。 3 ％戊巴比妥按 1 ml / kg 耳缘静脉给药麻醉。于兔的每耳腹侧面近、中、远端水平的内外侧各切除 1 个直径 1 cm 的创面，间隔≥1 cm ，建立兔耳增生性瘢痕模型(5)。手术在头戴显微镜下进行。术中需去除皮肤及耳软骨膜，显露耳软骨，在此过程中应尽量避免损伤耳软骨。设每只兔的 1 只耳的外侧 3 个创面为 BTA 注射组（ I 组），内侧 3 个创面为瘢痕组（ S 组），共 72 个创面（图 1 ）。 BTA 注射组术后立即于创缘皮下注射 A 型瘦脸（ ，兰州公司） , 5U ／创面。所有创面压迫止血，无菌敷料包扎。全身用抗生素 7d 预防感染。 I 组术后第 2 天改为含 SU BTA 溶液的 3M 敷料湿敷创面 7d ，此后常规换药创面愈合。 S 组0.9 ％生理盐水湿敷换药。大体观察创面愈合时间和瘢痕增生情况，统计术后 14d时的创面愈合率。术后 28d 时，以同样方法另取 6 只兔子，每只兔耳腹侧面正常皮肤为空白对照组（ C 组），共 36 个创面。收集 3 组标本，并将每个标本 1 / 2 等分。实时定量 PCR 检测各组 1 / 2 标本中 SP 、 TGF-β1 和 a-SMA 的 mRNA 含量， Western 印迹法检测另外 1 / 2 标本中 Q-SMA 的蛋白表达。

　　2 ．实时定量 PCR 检测：于术后 28d ，收集各组瘢痕组织和正常皮肤，进行实时定量 PCR 检测 SP , TGF 一甲和 a 一 SMA 的 mRNA 含量。实验步骤及方法见参考文献（5）。 3 种物质的引物由计算机辅助设计，由上海生工生物公司合成。 3 种物质及内参照物 GAPDH （甘油醛磷酸脱氢酶）的引物序列如下： SP : fs ' TGGTTTCCACCCAACTGTTTG3 ' , r5 ' GGGCAGCTCCTCCTTGATCT3 ' ; a 一 SMA : f5 ' TG - GCACCACTCCTTCTACAAT3 ' , r5 ' ATTTTCTC - CCGGTTGGCTTT3 αGF 一阻： f5 ' TGCGGCAGCT - GTACATTGAC3 ' , r5 ' GGCAGAAGTTGGCGTG - GTA3 乍 GAPDH : fs ' TTTTAACTCTGGCAAAGT - GGATGTT3 ; r5ACTTGCCGTGGGTGGAATC3 。

　　3 . Westem 免疫蛋白印迹分析：提取标本组织的总蛋白，采用 Bradford 标测法制备蛋白质标准曲线，测量蛋白质浓度。将含 30 拼 g 的总蛋白于 10 % SDS-聚丙烯酞胺变性凝胶电泳。电转移硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭，以特异性抗 a-SMA 抗体 ( 1:200 ）孵育 4 ℃ 过夜，充分洗涤后辣根过氧化物酶标记二抗。 ECL 化学发光， X 光片曝光。计算机图像分析，测定灰度值，代表蛋白的表达量。

　　三、统计学处理

　　х2检验术后 14d 时的创面感染率和愈合率。实时定量 PCR 数据和蛋白印迹密度数据以δ士s 表示。采用 SAS 6 . 12 统计软件进行单因素方差分析，以尸P＜ 0 . 05 为差异有统计学意义。

　　结果

　　一、大体观察瘦脸对创面愈合的影响

　　术后第 2 天检测创面， I 组创面干爽、渗出少； S 组创面炎性渗出较多。术后第 4 天，两组均发现局限性软骨下积脓， S 组 7 只例， I 组 10 只，引流脓液，磺胺嚓陡银软膏外敷 2 次后感染控制，创面恢复肉芽组织生长。术后 7d ，除感染创面外，其他创面已长满肉芽组织。 S 组、工组创面愈合时间分别为 ( 14 . 56 士 1 . 74 ) d 和（ 15 . 02 士 2 . 07 ) d ( P > 0 . 05 ）。统计术后 14d 两组的创面感染率和愈合率，х2值分别为 0 . 60 和 0 . 86 (х2< 3 . 84 , P > 0 . 05 ，表 1 ）。术后 28d , S 组已形成明显的增生性瘢痕，已愈合的圆形创面中央呈粉红色的小丘样凸出皮面，周缘中心点可见因瘢痕挛缩而形成的“放射线”样外观。 I 组瘢痕较平坦，挛缩不明显。两组的兔耳增生性瘢痕外观如图 2 所示。
 
一、术后 28d , 3 组标本中 SP 、 TGF-β，和。Α-SMA 的mRNA 含量S 组 3 种物质的 mRNA 含量较 C 组显著增高 ( P < 0 . 01 : Psp=0 . 002 , PTGF-β=0 . 004 , Pa-SMA = 0 . 003 ）。 I 组 SP 和 TGF-β1 、 a-SMA 的 mRNA 含量较 S 组显著降低（P＜0.01 PSP=0.009和P＜0.05:PTGF-β=0.012.Pα-SMA=0.032,但3种物质含量均较C组高（P＞0.05;PSP-β=0.023,PαSMA=0.027;表2，图三）
 
二、术后 28d , 3 组标本中 aSMA 的蛋白表达3 组标本的蛋白电泳在相对分子质量为 42 000 处均有条带显示， I 组 a 一 SMA 的条带灰度介于 S 组和 C 组之间。 3 组的 aSMA 蛋白印迹密度和 a 一 SMA 对尽肌动蛋白的蛋白印迹密度比值两组间差异均有统计学意义（P＜ 0 . 05 ：Pa-SMA=0.034, Pa-SMA=0.040.PPaSMA/β肌动蛋白＝ 0 . 035 , Pa-SMA/ β俘肌动蛋白=0. 011 ) ，且 S 组＞ I 组＞ C 组，见表 3 、图 4 。

　　讨论

　　创伤愈合后瘢痕持续增生挛缩，常伴痛痒症状是增生性瘢痕的主要特征。研究发现， SP 、 TGF-β和a-SMA 的表达异常与 HS 的痛痒、增生和挛缩密切相关。 SP 是产生和传导疼痛的主要神劷递质。 HS 中皮肤伤害感受器阑值降低， C 类神劷元兴奋性增高，释放 sP [Scott JR , Muangman PR , Tarnura RN , et al . SubstanceP levels and neutral endopeptidase activity in acute burn wounds and hypertrophic scar . Plast Reconstr Surg , 2005 , 115 ( 4 ) : 1095-1102 ]，导致 SP 染色阳性的神劷纤维数量明显增多(Henderson J Trenghi G , McGrouther DA , et al . The rein nervation pattern of wounds and scars may explain their sensory symptoms . J Plast Reconstr Aesthet Surg , 2006 , 59 ( 9 )942-950 ),SP 进而使血小板和肥大细胞释放 5-劷色胺（5-HT ）和组胺等活性物质，加重痛痒。 SP 还能上调大鼠肉芽组织和人 HS 来源的成纤维细胞表达TGF-β和a-SMA（Salo P , Bray R , Seerattan R , et al . Neuropeptides regulate expression of matrix rnolecule , growth factor and inflammatory mediator mRNA in explants of normal and healing medial collateral ligament . Regul Pept , 2007 , 142 ( 1-2 ) : 16 .Lai XN , Wang ZG , Zhu JM , et al . Effect of Substance P on gene expression of transforming growth factor betal and its receptors in rats fibroblasts . Chin J Traumatol , 2003 , 6 ( 6 ) : 350-354 ,H uD , Chen B , Zhu X , et al . Substance P up-regulates the TGFbeta 1 mRNA expression of human dermal fibroblasts in vitro . Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi , 2002 , 18 ( 4 ) : 234-236 .）TGF-β是瘢痕增长最密切的生长因子，能促进 FB 增殖和细胞外基质的合成，刺激 FB 表达 a-MA ，向肌成纤维细胞分化，而 aSMA 过多将导致瘢痕挛缩，故TGF-β阻和。a-SMA 的过高表达是 HS 的显著特征。我们在临床实践中发现， BTA 注射能抑制 HS 增生挛缩，有效缓解 HS 患者的痛痒症状。本实验通过检测兔耳增生性瘢痕中 SP 、 TGF-β甲和a-SMA 的表达，探索 BTA 注射治疗 HS 的理论依据。术后 14d , s 组和 I 组的创面感染率和愈合率差异无统计学，说明创面感染与 BTA 注射无关，分析原因为术中操作不慎损伤耳软骨所致，并且 BTA 注射未影响创面的正常愈合。术后 28d ,S组瘢痕增生明显。而 I 组瘢痕较平坦。 S 组 SP 、 TGF-β甲和 a-SMA 的 mRNA 含量较 C 组显著增高，为 HS 的显著特征。与 S 组相比， I 组 SP 的 mRNA 含量显著降低（P＜ 0 . 01 ) ，这是 BTA 注射可有效缓解 HS 痛痒症状的明证。其机制可能为：通过胞饮作用以及与突触前受体序列和突触囊泡蛋白 2A , B , C 的结合， BTA 能直接作用于非胆碱能神劷元和感觉神劷末梢，裂解突触小体相关蛋白，阻止突触小泡与突触前膜的融合停靠，抑制 SP 释放。 I 组TGF-β和。a-SMA 的 mRNA 含量较 S 组降低（P＜ 0 . 05 ) ，为 BTA 注射抑制 HS 增生挛缩提供了理论依据，但具体机制仍需深人研究。 I 组 3 种物质的 mRNA 含量均高于 C 组，说明 BTA 注射虽能降低 HS 中 SP 、 TGF-β和 a-SMA 的表达，但仍未降正常皮肤水平。蛋白水平上， a-SMA 的 Western 印迹法半定量检测结果与其 mRNA 检测结果一致。