大鼠颅骨体外培养矢状缝牵引成骨模型的建立

　　吴摘 王新刚 尹宁北 赵振民

　　［摘要］目的 探讨建立幼年 SD 大鼠颅骨器官体外培养矢状缝牵引成骨模型。方法 取 19 的 SD 大鼠颅顶骨矢状缝组织块， 10‐³N (0.4g)力，对照组不加力。培养 24 h 结束时，进行大体观察及倒置显微镜下观察；并劷苏木精-伊红染色后进行组织学观察。结果 大体观察及倒置显微镜下观察发现，实验组骨缝逐渐明显加宽，加排列24 h ，所有标本矢状缝未见断裂。组织学观察发现，缝两侧区域为成骨活跃部位，两侧骨化前沿交错缝内可见纤维结缔组织、成骨细胞、成纤维细胞及毛细血管，缝内组织与硬脑膜相连缝保持正常发育，未见明显变化，以成骨细胞为主。结论 大鼠颅骨骨缝器官可以在体外培养中成功存活并继续生长。

　　【 关键词 】 颅缝；器官培养技术；机械张力

　　Rat cranial sutures in vitro:a new experimental model for studying the osteogenic to tensile force WU Di,WANG Xin-gang,YIN Ning-bei, ZHAO Zhen-min．Department  of Cleft Lip and Palate,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China

　　[ Abstract ] objective To develop an in vitro model for cranial suture of neonatal SD rat .Methods  The parietal bones with the sagittal suture were removed from SD rats ( 19-days old ) for organ culture, In the experimental group , tensile force 3 . 92 х10‐³N(0.4g) was applied by helical springs ,whereas no applied tension ( ON ) was set in control group . explants were observed under inverted microscope . At the end of the incubation period for 24 hours , general conditions observed under inverted microscope and histological conditions were observed after hematoxylin and were observed after hematoxylin and eosin stain . Results  Under inverted micrope, sutures had no obviolls changes In control group , whereas sutures were enlarged gradually in the experimental group . With histological observation , sutures developed normally in control group , but in experimental group ,osteohlasts and capillary vessels proliferated actively in the suture . Conclusions In vitro model of cranfa cranial suture can be cultured and grown successfvel.

　　［Key words］ Cranial suture; Organ culture techniques；Stress , Mechanical

　　骨缝是颅面骨骼生长的主要部位，被硬脑膜等组织包绕，位于坚硬的骨骼之间。体外实验是将离体骨缝组织置于培养基中进行牵引，这不仅避免了体内综合因素的影响，还可单独对缝组织施加某种条件，以明确它的作用。我们通过颅骨骨缝器官培养和体外缝牵引技术，建立幼年大鼠颅骨矢状缝牵引成骨模型，从而能简便客观地研究颅缝牵引生物学变化规律。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1．牵引装置制备：按照 Hickory 和 Nanda 的方法设计螺旋弹簧(HiIckory WB , Nanda R . Effect of tensile force magnitude on release of cranial suture cells into 5 phase . Am J Orthod Dentofac Orthop , 1987 , 91 ( 4 ) : 328-334 .)。应用直径为25 mm 的正畸矫治钢丝弯制成螺旋弹簧，弹簧体部伸出两臂，臂分为水平部分和末端向下弯曲 900 的垂直部分。弹簧直径是 4mm ，圈数为 6 圈。臂水平部分长为 50 mm ，垂直部分为 7 mm 。当两臂末端压缩距离为 7mm 时即为 3 . 92х10‐³N ( 0 . 49 ）的张力，当垂直置人部分用胶布固定时即为 O N 张力。

　　2 ．动物标本的切取：选用 19 日龄的 sD 大鼠 20 只，由北京维康利华公司提供。术区消毒后，在解剖显微镜下暴显颅盖骨，包括两侧的顶骨及其间的矢状缝，其宽为 8 mm ，长为 10 mm ，保留颅骨外膜和硬脑膜。随机分为对照组（不加力）和实验组加 3 . 92 X 10‐³N ( 0 . 49 ）力进行体外培养（图 1 ）。

　　二、方法

　　1 ．器官培养：将颅盖骨标本放人装有无酚红高糖型 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（ DMEM ）的培养皿中，在 37 °C 、 5 ％的 CO2 ：孵育箱中培养。培养基中加入10%的牛颌血，青霉素，链霉素。于24 h 收集组织标本。

　　2 ．组织学处理：将培养 24h 的标本置于 10 % 中性甲醛溶液中固定 10h 后，用乙二胺四乙酸 ( EDTA ）脱钙液（由中杉金桥试剂公司提供）脱钙 10d ，常规脱水，石蜡包埋，制作 4μm 厚的切片。
 
3 ．苏木精一伊红（ HE ）染色：苏木精染液浸泡 3～4min ，流动自来水冲洗； 1 ％盐酸乙醇分化数秒，流动自来水冲洗； 1 ％氨水显蓝 30s 1 min ，流动自来水冲洗后镜检；伊红染色 40s，流动自来水冲洗 30s ；置于 75 ％乙醇中 20s ; 95 ％乙醇中 l～Zmin ，共 2 次；无水乙醇中 1～Zmin ，共 2 次；置于二甲苯工中 2min ，二甲苯 11 中 2min ；中性树胶封片。

　　结果

　　一、大体观察

　　大鼠颅骨标本劷体外培养 24h 后，标本未见坏死。对照组骨缝未见明显变化。实验组应用弹簧进行缝牵引后，骨缝逐渐加宽，加力 24h 有标本矢状缝未见断裂。

　　二、倒置显微镜下观察于低倍倒置显微镜下观察，培养液未见细菌污染，颅骨标本未见坏死。对照组骨缝未见明显变化。实验组应用弹簧牵引后，骨缝逐渐加宽，加力 24h ，所有标本矢状缝未见断裂，与大体观察相吻合（图 2 ）。 

　　三、组织学表现实验组标本骨缝明显增宽，缝两侧区域为成骨活跃部位，两侧骨化前沿交错排列。缝内可见纤维结缔组织、成骨细胞、成纤维细胞及毛细血管，缝内组织与硬脑膜相连；两侧骨化前沿可见有成骨样细胞，说明不断有新骨形成。对照组标本骨缝保持正常发育，以成骨细胞为主。对照组和实验组均未见组织坏死（图 3 ）。

　　讨论

　　在正常生理状态下，颅面骨缝处于几种力的综合作用下，大致分为压力、拉力及切应力。张力的产生主要来自于生长中的脑组织，它对颅顶产生向外的作用力。对于颅顶内表面及其骨缝而言是一种压力，促进骨吸收；而对于外表面及其骨缝又是一种拉力，促进骨形成。这两种力综合作用的结果便使颅骨容积增大(Sun Z , Lee E , Herring SW . Cranial SutureS and bones : growth and fusion in relation to masticatory strain . Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol , 2004 , 276 ( 2 ) : 150- 161 .)。可以这样认为，骨缝使颅骨纵向生长，如果没有骨缝，颅骨将只能增厚。张力还可产生于咀嚼肌，它通过邻近的骨传递给缝，既可表现为拉力，也可表现为压力。除此以外，有报道认为颅面骨缝还受到切应力的作用［ Rafferty KL , Herring SW , Marshall CD . BiomechanicS of the rostrum and the role of facial Sutures . J Morphol , 2003 , 257 ( 1 ) : 33-44 . ］。由于其检测技术复杂，切应力一般并不单独用于骨缝的研究。但我们应该考虑到，在对骨缝施加拉力或压力时，切应力可能会随之产生，这将影响实验结果的准确性。

　　几乎所有的颅面骨缝都曾被用于张力研究［ Alaqeel SM , Hinton RJ , opperman IA . Cellular response to force application at craniofacial sutures . Orthod Craniofacial Res , 2006 , 9 ( 3 ) : 111-122 . ］。本实验选择颅骨矢状缝为研究对象。对于体内实验，矢状缝和冠状缝最为常用，因为上颌骨在矫正颅面部畸形中的重要作用，对其周围骨缝的研究也很多。选择骨缝一个很重要的原则应是易于获取，覆盖颅骨矢状缝的软组织血供少，又无肌肉附着，远离口鼻区域，切取标本及培养时不易被污染机械张力对颅面骨缝作用的实验研究主要分为体内及体外两种。体内实验是对不同动物的骨缝施加直接或间接张力，观察受力后缝的变化情况。其中间接张力可以来自缝周围的牙齿或肌肉，通过改变牙齿或肌肉的力量间接影响骨缝的受力程度［Byron CD , BorkeJ , Yu J , et al . Effects of increased muscle mass on muouse sagittal suture morphology and mechanics . Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Blol , 2004 , 279 ( 1 ) : 676-684 .Hamrick MW , Samaddar T , PenningtonC , et al . Increased muscle mass with myostatin deficiency improves gains in bone strength withe 父 ercise . J Bone Miner Res , 2006 , 21 ( 3 ) : 477- 483〕 。先前的体内实验，加力系统力值通常在作用于被研究的颅面骨缝之前测量，由于颅面结构的复杂性，在加力系统作用于颅面骨缝时，有部分力作用于颅面骨缝之外的其他结构。

　　因此，很难通过体内实验研究力的变化和组织学反应之间的相关性，体内实验研究不能真实反映骨缝受外力作用后的骨改建情况。体外实验是将离体骨缝组织置于培养基中进行牵引，这避免了骨缝周围组织和全身因素的影响。本实验采用体外研究方法。自制螺旋弹簧，以颅缝为中心，两侧正中打孔安置弹簧，孔距 7 mm 。当弹簧压缩为 7 mm 时产生 3 . 92xl0³ N ( 0 . 4g）张力，这样控制弹簧力的大小和方向，避免旋转。

　　对骨缝施加张力后，内部细胞数量和活性都会随之改变。成骨细胞和破骨细胞的比例将决定最终发生合成还是分解反应。当骨缝受拉力作用，成骨细胞、骨细胞和毛细血管均增加；成纤维细胞对力大小的变化也很敏感，随着力值的增加，成纤维细胞的数量也会增加；力的作用时间及大小对骨祖细胞都会产生作用，较大的张力在初期会使细胞数量增加，随后会迅速减少。而以较小的张力持续作用于骨缝也会使骨祖细胞增加。骨缝受到压力作用会产生相反的效果，破骨细胞增加，破骨活性强于成骨活性，引起分解反应。在机械张力的作用下，主要由骨缝中的成骨细胞和成纤维细胞分泌多种细胞因子，包括月转化生长因子（ TGF 一因、胰岛素生长因子 (TGF-β ）、成骨蛋白（ BMP ）、碱性成纤维细胞生长因子 ( bFGF ）等(Maxson R , lshii M . The Bmp pathway in Skull vault development . Front Oral Biol , 2008 , 12 : 197-208 . H irukawaK , MiyazawaK , MaedaH , et al , Effect of tensile force on the expression of IGPI and IGF-1 receptor in the organcultured rat cranial suture . Arch Oral Biol , 2005 , 50 (3)：367-372 . Song HM , Fong KD , Nacamuli RP , et al . Mechanisms of murine cranial suture patency mediated by a dominant negative transforming growth factorbeta receptor adenovirus . Plast Reconstr Surg , 2004 , 113 ( 6 ) : 1685-1697 .)，它们通过自分泌和旁分泌调节成骨细胞的活性。
组织学分析是反映骨缝生长发育的一个实用指标。本实验模型的组织学观察是：对照组标本骨缝保持正常发育，以成骨细胞为主。实验组标本骨缝明显增宽，缝内成骨细胞活跃，毛细血管增生。未见组织坏死和细菌感染。提示骨缝器官能在体外培养中存活并能继续生长发育，证明本模型建立成功.骨缝器官培养与细胞培养相比更接近于机体内的生长情况，体外器官培养在机械张力对颅面骨缝成骨作用的研究中有实用价值。

　　综上所述，骨缝是一种独特的组织，它可以向成骨细胞及成纤维细胞分化，成骨细胞分泌骨基质，而成纤维细胞对其有抑制作用，从而维持缝的稳定。当施加机械刺激时，在多种细胞因子的参与下，两种细胞重新达到平衡，或者促进骨形成，或者引起骨吸收。今后我们将在细胞水平、分子水平及基因水平研究骨缝的机械传导通路，以便能以最适合的机械刺激指导临床治疗。